Analisi strumentale: cromatografia 1 PDF - Università San Raffaele

Docente Alessandra De Bruno Lezione Analisi strumentale: cromatografia 1  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø Che cosa si intende per cromatografica? Ø Principi generali della cromatografia; Ø Nascita della cromatografia; Ø Meccanismi su...

Docente Alessandra De Bruno Lezione Analisi strumentale: cromatografia 1  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø Che cosa si intende per cromatografica? Ø Principi generali della cromatografia; Ø Nascita della cromatografia; Ø Meccanismi sui quali si basa la separazione cromatografica Ø Esempi di tecniche cromatografiche Analisi strumentale: cromatografia 1 2 di 27  Alessandra De Bruno Tecniche di separazione Cristallizzazione Filtrazione Distillazione Estrazione Centrifugazione Cromatografia Solvente selettivo Tecnica che separa Passaggio selettivo in grado di Seleziona le in base alla di un liquido e sciogliere di meno Evaporazione Solubilizzazione sostanze a seconda differente affinità trattenimento di un la sostanza da selettiva selettiva del diverso peso delle sostanze con solido attraverso cristallizzare specifico una fase un filtro rispetto alle altre stazionaria Analisi strumentale: cromatografia 1 3 di 27  Alessandra De Bruno 1. Che cosa si intende per cromatografica? Si tratta di una tecnica separativa usata per analizzare miscele complesse di sostanze. Le applicazioni della cromatografia vanno dal monitoraggio di una reazione chimica alla purificazione dei prodotti di una sintesi, alle analisi quali-quantitativa di campioni complessi. Analisi strumentale: cromatografia 1 4 di 27  Alessandra De Bruno 1.1 Principi generali della cromatografia La cromatografia è una tecnica analitica che consente di separare le componenti di una miscela omogenea, sfruttando la diversa affinità delle molecole o degli ioni di due diverse fasi: la fase fissa, chiamata anche fase stazionaria perché viene immobilizzata. la fase mobile, chiamata anche eluente, che viene fatta scorrere in modo continuo nella fase stazionaria. Analisi strumentale: cromatografia 1 5 di 27  Alessandra De Bruno La cromatografia trova fondamento nella diversa affinità di un analita per le due fasi, mobile e stazionaria: maggiore è la propensione di un componente per la F.S. e più tempo questi impiegherà ad attraversare la colonna; diversamente se l'analita ha maggiore affinità verso la F.M., questi ultimerà il percorso della colonna con maggior rapidità. Analisi strumentale: cromatografia 1 6 di 27  Alessandra De Bruno 2. Nascita della cromatografia Si deve al botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio (l’eluente), lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio (che ha il ruolo di adsorbente) ed eluì. I vari pigmenti si separarono in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla. Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco: chrômatos, colore + graphía, scrivere, letteralmente scrittura del colore Analisi strumentale: cromatografia 1 7 di 27  Alessandra De Bruno La maggior parte delle tecniche cromatografiche si ispirano ad un unico esperimento fondamentale, quello di Tswett: v Si impacca in una colonna la fase stazionaria; v La miscela da separare viene depositata in testa alla colonna che poi deve essere riempita con la fase mobile in modo tale che tutta la colonna sia piena; v Si aggiunge in modo continuo la fase mobile, affinché, scorrendo attraverso la fase stazionaria, trascini con sé i diversi componenti della miscela in base alle diverse affinità con le due fasi; Analisi strumentale: cromatografia 1 8 di 27  Alessandra De Bruno v Si raccolgono le frazioni di volume noto in una serie di recipienti; v Al termine della separazione cromatografica si avranno le componenti della miscela in diversi contenitori e si può tracciare un istogramma in cui sull’ordinata compare la massa e sulle ascisse il volume di ritenzione (VR). Il volume di ritenzione è il volume necessario per far uscire completamente tutti i componenti della miscela. v La massa o concentrazione la si può ottenere pesando i recipienti dopo aver fatto evaporare l’eluente, oppure tramite un esame in assorbimento, se le sostanze colorano la soluzione. Analisi strumentale: cromatografia 1 9 di 27  Alessandra De Bruno 3. MECCANISMI SUI QUALI SI BASA LA SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA adsorbimento ripartizione scambio ionico esclusione affinità La fase stazionaria interagisce con i componenti da separare in maniera diversa con l’effetto di diversificare la loro velocità e quindi il tempo di transito attraverso essa. Differente tempo di ritenzione Analisi strumentale: cromatografia 1 10 di 27  Alessandra De Bruno 3.1 Adsorbimento: La fase stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire legami secondari (dipolodipolo, ponte di idrogeno, Van der Waals) con le diverse molecole della miscela da risolvere (separare). Se la fase mobile è un liquido si parla di cromatografia liquido-solido (LSC), se invece è un gas, di cromatografia gas-solido (GSC). In genere, le molecole che più facilmente vengono fissate sono quelle che presentano gruppi polari, anche se la natura dell’adsorbente influisce sul fenomeno. Analisi strumentale: cromatografia 1 11 di 27  Alessandra De Bruno 3.2 Ripartizione: La fase stazionaria è un liquido, in cui si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze da analizzare. Esse pertanto si ripartiscono fra le due fasi (immiscibili tra loro) e la costante K prende il nome di coefficiente di ripartizione. Se la fase mobile è un gas si parla di cromatografia gas liquido (GLC), se invece è un liquido, di cromatografia liquido-liquido (LLC). Analisi strumentale: cromatografia 1 12 di 27  Alessandra De Bruno 3.3 Scambio ionico: La fase stazionaria è costituita da molecole contenenti gruppi attivi, dotati di cariche elettriche (positive o negative), i quali sono in grado di scambiare i propri controioni con la soluzione da cui vengono lambiti, attraverso un meccanismo di competizione tra gli ioni della fase stazionaria e quelli con la stessa carica contenuti nella fase mobile. Anche in questo caso la separazione avviene secondo un criterio di affinità per la fase stazionaria, criterio dettato dalla maggiore o minore competitività. Analisi strumentale: cromatografia 1 13 di 27  Alessandra De Bruno 3.4 Esclusione dimensionale: Utilizzando una fase solida porosa (o un gel) con pori di opportune dimensioni. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi 3.5 Affinità In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Analisi strumentale: cromatografia 1 14 di 27  Alessandra De Bruno 4. VISUALIZZAZIONE DELLA SEPARAZIONE Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluito (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma. La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione. L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo. Analisi strumentale: cromatografia 1 15 di 27  Alessandra De Bruno Tempo di ritenzione Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Analisi strumentale: cromatografia 1 16 di 27  Alessandra De Bruno 5. ESEMPI DI TECNICHE CROMATOGRAFICHE La classificazione fondamentale dei metodi cromatografici si basa sul tipo di fase mobile 1. Cromatografia Liquida (LC) 2. Gascromatografia (GC) 3. Cromatografia fluida supercritica (SFC) La cromatografia liquida può essere realizzata su colonna, su strato sottile e su carta. La gas-cromatografia è limitata all’uso della colonna Analisi strumentale: cromatografia 1 17 di 27  Alessandra De Bruno 5.1 La Cromatografia Liquida (LC) Si tratta di una tecnica cromatografica che consente la separazione di un gran numero di molecole organiche e inorganiche a temperatura ambiente. La cromatografia per HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni o pressioni) può essere definita come una tecnica di separazione in colonna di analiti mediante l’interazione tra questi sia con la fase stazionaria che con quella mobile. Analisi strumentale: cromatografia 1 18 di 27  Alessandra De Bruno Fase stazionaria (FS): Il supporto solido della fase stazionaria contenuta nelle colonne è costituita da particelle di silice o polimeri di sintesi, che possono essere irregolari o di forma sferica e con diverso diametro. Attualmente si utilizzano prevalentemente particelle sferiche in quanto presentano una maggiore efficienza e una migliore riproducibilità di impacchettamento. La silice è il materiale più utilizzato e studiato come adsorbente per HPLC è ciò, soprattutto, grazie alla straordinaria reattività chimica della sua superficie. Analisi strumentale: cromatografia 1 19 di 27  Alessandra De Bruno La fase stazionaria è impaccata in una colonna di lunghezza variabile tra 3 e 50 cm e di diametro interno (ID) di pochi mm. Poiché le particelle del riempimento hanno una granulometria molto piccola (da 3 a 10 mm) il flusso dell’eluente può essere ottenuto solo esercitando una pressione relativamente elevata mediante apposite pompe Analisi strumentale: cromatografia 1 20 di 27  Alessandra De Bruno LE TECNICHE CROMATOGRAFICHE, POSSONO ESSERE SUDDIVISE: 1. In base alla polarità delle fasi: Cromatografia a fasi normali (NPC) Fase stazionaria polare e fase mobile apolare Cromatografia a fasi inverse (RPC) Fase stazionaria apolare e fase mobile polare 2. In funzione del meccanismo della separazione Cromatografia di adsorbimento (LSC) Cromatografia di ripartizione (LLC) Cromatografia di esclusione (SEC) Cromatografia di scambio ionico (IEC) Cromatografia di affinità (AFC) Cromatografia di coppia ionica (IPC) 3. In base alle caratteristiche della fase stazionaria Cromatografia su fase legata (BPC) Cromatografia su fase chirale (CPC) Analisi strumentale: cromatografia 1 21 di 27  Alessandra De Bruno Fase mobile (FM): Le FM usate generalmente in HPLC sono costituite da una miscela di uno o più solventi caratterizzati da: 1. Proprietà fisiche: elevata purezza, basso costo, trasparenza UV, non corrosive, bassa viscosità, bassa tossicità, non infiammabili, solventi il campione; 2. Forza: correlata alla polarità del solvente (es. l’acqua è un solvente forte in fase normale, ma debole in fase inversa); 3. Selettività. Per modificare le FM si utilizzano tamponi; acidificatori, modificatori basici…. Analisi strumentale: cromatografia 1 22 di 27  Alessandra De Bruno STRUMENTAZIONE L’apparecchiatura è costituita da una sistema a pompe (fino a 4), un blocco iniettore, una colonna, un detector e un elaboratore dati. Il cuore dello strumento è rappresentato dalla colonna. Analisi strumentale: cromatografia 1 23 di 27  Alessandra De Bruno Esistono 4 tipi di pompe: pneumatiche, a siringa, ad La scelta del rivelatore va fatta in base alla natura amplificazione idraulica e reciprocanti. La maggior parte delle degli analiti da analizzare. Sono disponibili pompe utilizzate sono reciprocanti, ossia aspirano il liquido rivelatori: a indice di rifrazione, UV-VIS e a serie dal contenitore esterno e lo inviano in colonna. di diodi; a Fluorescenza; a luce diffusa, etc Fino a 4 bottiglie in vetro generalmente da 1 L. Iniettore: consente di introdurre direttamente il campione in colonna. Generalmente in acciaio inox. Sono collegate da un lato alla L’iniezione può essere manuale pompa (ingresso della miscela eluente) e dall’altro al o tramite autocampionatori detector (uscita della miscela eluente con gli analiti separati). Analisi strumentale: cromatografia 1 24 di 27  Alessandra De Bruno Eluizione isocratica Usata quando i componenti di un campione Fase mobile possiedono ad esempio caratteristiche di Eluizione a gradiente polarità molto differente I riempimenti più usati nella cromatografia liquida di ripartizione, hanno la fase Fase stazionaria legata chimicamente al supporto. Le fasi legate più usate sono di stazionaria natura apolare, con una catena alchilica, legata tramite un atomo di silicio dell’alchilsilano ( fase inversa). Controllo del flusso Vengono classificate in base alla variabile Pompe della fase mobile che viene controllata: pressione o flusso della fase mobile. La pressione aumenta linearmente con il flusso. Tutti i sistemi di pompaggio hanno un limite massimo di pressione Analisi strumentale: cromatografia 1 25 di 27  Alessandra De Bruno Iniettore Il campione viene iniettato tramite microsiringhe. Generamente hanno una lunghezza tra 25 e 30 cm e sono riempite con Colonne materiali a granulometria molto fine 5-10 µm. Il diametro interno delle colonne oscilla tra 2-5 mm. Le colonne più moderne sono lunghe da 3-15 cm e sono riempite con materiale sferico da 3-5 µm. La colonna può essere usata a temperatura ambiente o a temperature elevate. Il controllo della Fornetto temperatura è un parametro importante per avere un alta precisione analitica. Quelli maggiormente usati sono i rivelatori ottici. Il raggio luminoso, attraversa il liquido in uscita dalla colonna , in un opportuna microcella a flusso. La variazione dell’intensità di luce , per assorbimento dei raggi UV, emissioni fluorescenti o indice di rifrazione , provocate dal passaggio dei componenti del campione, vengono trasformate in una Rivelatori variazione di tensione in uscita. Queste variazioni, vengono inviate ad un registratore potenziometrico o immesse in un sistema di elaborazione computerizzato. Il rivelatore maggiormente utilizzato nella cromatografia liquida è quello UV (190-350 nm). Analisi strumentale: cromatografia 1 26 di 27  Alessandra De Bruno METODI DI ANALISI Analisi qualitativa Identificazione picco. Si esegue con l’ausilio dei tempi di ritenzione, che vengono confrontati con i dati ottenuti analizzando gli standard alle medesime condizioni. Analisi quantitativa Basata sulla misura delle aree dei picchi. È da considerare che la risposta del rivelatore può variare ampiamente. Analisi strumentale: cromatografia 1 27 di 27