Técnica CH50 y Proliferación de Linfocitos

UT5. Valoración de la Funcionalidad de la Inmunidad Celular

• Los linfocitos son responsables de la inmunidad específica. Estudiarlos es crucial para comprender el sistema inmune.
• Los estudios incluyen pruebas de funcionalidad y cuantificación.
• Se necesita separar los linfocitos del resto de componentes sanguíneos antes de realizar estudios.

Técnicas de Separación de Linfocitos

• El gradiente de Ficoll es el método más común para obtener preparaciones de linfocitos purificadas o enriquecidas para estudios in vitro.
• La sangre total desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se coloca en un tubo hasta la mitad con Ficoll.
• Se centrifuga la muestra para separar los linfocitos de los otros componentes sanguíneos.
• En realidad, se separan los leucocitos mononucleares (linfocitos y monocitos). Los linfocitos son más abundantes en la sangre periférica.

El Medio de Separación (Gradiente de Ficoll)

• El gradiente es discontinuo y tiene dos componentes principales:
  • Ficoll 400: Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina de 400 kDa soluble en agua. Tiene mayor densidad que los linfocitos, pero menos que los eritrocitos y granulocitos. Provoca aglutinación de eritrocitos.
  • Diatrizoato de sodio: Mezclado con Ficoll, se utilizan para obtener soluciones de baja viscosidad y alta densidad. Proporciona la densidad óptima para la separación celular y la osmolaridad necesaria para que las células permanezcan viables.

Preparación del Medio (Gradiente de Ficoll)

• Preparar una disolución al 14% p/v de Ficoll 400, agitando toda la noche a temperatura ambiente.
• Mezclar 12 partes de solución de Ficoll con 5 partes de diatrizoato de sodio al 32,8%.
• Ajustar la densidad y la osmolaridad.
• Esterilizar por filtración.
• Conservar a 4°C en oscuridad (el diatrizoato de sodio es fotosensible).
• Se pueden encontrar preparaciones comerciales disponibles.

Fundamento del Proceso (Gradiente de Ficoll)

• Mediante centrifugación de la sangre desfibrinada en el medio de separación se consigue:
  • Separación de granulacitos (más densos que el medio), que sedimentan en el fondo.
  • Separación de eritrocitos (que se aglutinan al contactar con el Ficoll y sedimentan en el fondo).
  • Las células mononucleares (linfocitos y monocitos) permanecen en la interfase entre el plasma y el medio de separación debido a su menor densidad.
• Se observan tres fases principales en la centrifugación:
  • Fase superior: Plasma.
  • Fase intermedia: Células mononucleares.
  • Fase inferior: Eritrocitos y granulocitos.

Procedimiento

• Preparar el medio (si se usa comercial, se añade directamente).
• Diluir la sangre total (EDTA) en medio de cultivo (Ej: RPMI).
• Colocar la sangre diluida sobre el medio de separación (sin mezclar).
• Centrifugar a 400 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente y en rotor oscilante.
• Separar las tres fases. Retirar la superior y desechar. Recoger la intermedia (linfocitos) y traspasar a un nuevo tubo. La inferior se descarta.
• Añadir 10 ml de medio sin suero a la fase recogida y resuspendender.
• Lavar las células por centrifugación (100 xg, 10 minutos) y repetir el proceso.
• Añadir medio de cultivo con suero bovino para la conservación.
• Cuantificar la viabilidad celular y realizar un recuento (ej: usando azul de tripán).

Estudio de los Linfocitos B

• Se puede analizar induciendo la mitosis de los linfocitos in vitro, usando varios métodos.
• Las determinaciones in vitro reflejan los mecanismos de activación y proliferación celular a lo largo de la respuesta inmunológica in vivo.
• Se evalúa la producción de anticuerpos (IgG, IgM e IgA) para diagnosticar inmunodeficiencias. Los métodos incluyen inmunodifusión radial y turbidimetría.
• La detección de antiG y antiA por ELISA es importante cuando hay inmunodeficiencias en la producción de IgM.
• Se pueden medir las subclases de inmunoglobulinas frente a diferentes antígenos, como la IgG2 frente a polisacáridos de neumococos (en infecciones por bacterias encapsuladas).
• Para evaluar la producción de anticuerpos, se utilizan los sobrenadantes de cultivos in vitro estimulados por antígenos, con técnica ELISA.

Estudio de los Linfocitos T

• Se pueden usar distintas técnicas para evaluar la proliferación de linfocitos T.
• Se pueden estudiar la proliferación en respuesta a mitógenos.
• Se puede usar la citometría de flujo.
• Se puede usar la valoración de citoquinas.
• Se puede realizar una prueba de hipersensibilidad cutánea retardada.

Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos

• Los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno in vitro, se transforman en linfoblastos que se dividen activamente en presencia del antígeno o de un agente mitógeno.
• La proliferación de linfoblastos implica síntesis de ADN, que se puede medir por la tasa de incorporación de timidina tritiada.
• Los pasos incluyen la preparación de la muestra (separación de linfocitos), incubación, recolección de las células sobre filtros, uso de líquido de centelleo para la radiactividad y medición de la radiactividad de las células para analizar la proliferación.

Estudio de proliferación mediante citometría de flujo

• Se utiliza un marcador en los linfocitos, evaluando la reducción en la intensidad de la señal de fluorescencia, proporcional a la actividad mitógena.

Valoración de citoquinas

• Se estudian los sobrenadantes de cultivos estimulados con antígenos o mitógenos usando un ELISA en sándwich de dos anticuerpos.
• Se añaden anticuerpos monoclonales al inicio, después la muestra problema y se lava el exceso. Se añade otro anticuerpo monoclonal marcado con biotina, se incuba y se lava.
• Después, se añade el conjugado y se incuba a temperatura ambiente hasta que se observe el cambio de color.
• Se mide la intensidad del color en el lector de placas, utilizando una curva patrón. Los resultados positivos superan 3 desviaciones estándar del valor medio de la muestra control negativa.

Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada

• Es una inoculación intracutánea de una cantidad conocida de antígeno PPD (proteína purificada).
• Tras 48-72 horas, se observa la zona de la inyección.
• La prueba es positiva si aparece una pápula con un diámetro mayor de 2 mm.
• Un resultado positivo puede indicar un posible tipo de inmunodeficiencia.

Inmunodeficiencias (Conjuntos y Adquiridas)

• Se lista una serie de inmunodeficiencias congénitas y adquiridas que afectan la función inmunitaria celular.

Técnicas de Separación de Linfocitos (Alternativas)

• Separación celular inmunomagnética: usa partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos para separar subpoblaciones linfocitarias (por ejemplo, linfocitos B) de otras poblaciones celulares. (Magnetic Activated Cell Sorting)
• Técnicas de inmunotoxicidad: se produce la lisis de las poblaciones de interés con anticuerpos y proteínas del complemento.

Citometría de flujo

• La citometría de flujo es una técnica que permite separar poblaciones celulares basándose en sus propiedades físicas y/o químicas.

Filtración con columnas de lana de Nilon

• Permite la separación de linfocitos T de otras células como linfocitos B y monocitos, que se adhieren a la lana de nilón. Los linfocitos T atraviesan la columna o jeringa. El rendimiento es bajo (15-12%).

Panning para linfocitos

• Técnica que utiliza placas a las que se unen selectivamente células deseadas, como subpoblaciones de linfocitos (Ej: Linfocitos B).

Estudio del Complemento

• El sistema del complemento está formado por un conjunto de proteínas plasmáticas que se activan en cascada como consecuencia de distintos estímulos.
• Su función principal es producir la lisis de las membranas de los agentes patógenos.
• Promueve procesos inflamatorios y contribuye a la fagocitosis y eliminación de inmunocomplejos. El depósito de componentes del complemento puede causar enfermedad.
• Se puede activar por tres vías diferentes: clásica, alternativa y de las lectinas.

Cuantificación de C3 y C4

• La cuantificación se realiza mediante inmunodifusión radial o inmunonefelometría
• estas técnicas analizan tanto los componentes funcionales como los inactivos y fragmentos de degradación.

Análisis de la Vía Clásica (Técnica CH50)

• Mezcla suero fresco con una suspensión de eritrocitos sensibilizados para activar la vía clásica del complemento.
• Se crea una curva patrón con diferentes concentraciones de suero problemático para determinar la cantidad que produce la lisis del 50% de los eritrocitos.
• La cantidad de suero que causa el 50% de lisis es la unidad hemolítica 50 (CH50). Una técnica es realizar una prueba de homólisis en un gel de agarosa.

Ensayos de Quimiotaxis

• Se utilizan para evaluar la capacidad de los neutrófilos de desplazarse en forma direccional siguiendo un estímulo (agente quimiotáctico).
• Se utilizan cámaras de Boyden que separan compartimentos de células y agentes quimiotácticos.
• Las células intentan desplazarse hacia el agente, quedan retenidas en la membrana y se ven por microscopio.

Evaluación de la Capacidad Fagocítica

• Incubar una fracción de leucocitos con partículas inertes o microorganismos (Ej: bacterias, levaduras) para permitir la fagocitosis.
• La técnica no distingue entre partículas fagocitadas y moléculas adheridas a la superficie.
• La fagocitosis se puede evaluar usando un microscopio de fluorescencia y bacterias marcadas con colorantes fluorescentes.

Evaluación de la Activación de los Fagocitos

• Se realiza mediante la prueba de reducción de cloruro de tetrazolio (NBT).
• El NBT permite evaluar el estallido respiratorio, que ocurre justo después de la activación de los fagocitos.
• El estallido respiratorio está causado por la producción de anión superóxido por el sistema NADPH oxidasa, que se transforma en peróxido de hidrógeno. El NBT es un compuesto soluble en agua que cambia su color cuando es reducido, proporcionando un indicador del proceso de estallido respiratorio.
• En algunas inmunodeficiencias hay defectos en el sistema NADPH oxidasa y los fagocitos no pueden reducir el NBT.

Evaluación de la Actividad Microbiana

• Investigar la capacidad que tienen los fagocitos para eliminar microorganismos (bacterias o levaduras).
• Se mide la viabilidad de los microorganismos después de que los fagocitos los hayan ingerido.
• La reducción en el número de microorganismos indica que los fagocitos los han eliminado.

Otros Datos

• Se proporciona una lista de posibles materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo los experimentos y análisis mencionados.
• Algunas imágenes ilustran los procedimientos de laboratorio, técnicas y componentes relacionados con el sistema inmunitario.
• Se incluyen enlaces a vídeos (YouTube) e Instagram.

Este cuestionario evalúa tu comprensión sobre la técnica CH50 y la proliferación de linfocitos. Incluye preguntas sobre hemólisis, diluciones, y el papel de mitógenos y gases en la incubación. Prepárate para demostrar tu conocimiento en estas técnicas inmunológicas.