Freshney: نیازهای آزمایشگاه کشت بافت

Alireza Khosravani

• تکنولوژیست آزمایشگاه پزشکی دارای مدرک کارشناسی
• کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی
• تکنولوژیست فلوسیتومتری و کشت سلولی

Freshney

• طراحی، چیدمان و تجهیزات آزمایشگاه (واحد 3)
• تجهیزات و مواد (واحد 4)
• تکنیک آسپتیک (واحد 5)
• ظرف کشت و سوبسترا (واحد 7)
• محیط های تعریف شده و مکمل ها (واحد 8)
• آماده سازی و استریلیزاسیون (واحد 10)
• آلودگی (واحد 18)

نیازهای خاص یک آزمایشگاه کشت بافت

• هود جریان لامینار باید به طور مناسب جدا شده و دارای مکانی تمیز با دسترسی محدود باشد
• یک هود جریان افقی ارزان تر است و بهترین محافظت استریل را برای کشت ها ارائه میدهد
• فقط برای تهیه محیط (بدون آنتی بیوتیک) و سایر معرف های استریل غیر سمی و کشت سلول های غیر پریمات مناسب است
• به ویژه برای تشریح مواد غیر پریمات برای کشت های اولیه مناسب است

برای مواد بالقوه خطرناک

• باید از کابینت های ایمنی میکروبیولوژیکی کلاس II یا کلاس III استفاده شود - این مواد شامل پریمات ها، از جمله انسان، خطوط سلولی، کشت و سوبسترهایی که ویروس تولید میکنند، رادیوایزوتوپ ها و داروهای سرطان زا یا سمی است
• در عمل، بیشتر آزمایشگاه ها اکنون به طور استاندارد از یک کابینت ایمنی میکروبیولوژیکی کلاس II استفاده میکنند

تجهیزات کشت بافت

• پیپت(ها)
• کنترلر پیپت(ها)
• فریزر نیتروژن مایع
• همزن مغناطیسی
• سینک شستشوی عمیق
• پیپت شوی/خشک کن پیپت
• پیپت پلاگ
• سانتریفیوژ رومیزی
• هود جریان لامینار (کابینت ایمنی زیستی)
• انکوباتور CO2
• میکروسکوپ معکوس، دوربین برای میکروسکوپ معکوس
• میکروسکوپ(ها)
• لام هموسیتومتر
• فریزر یخچال
• حمام خیساندن یا سینک استوانه پیپت
• پمپ پریستالتیک

استریلیزاسیون

• بیشتر استریلیزاسیون را میتوان در اتوکلاو انجام داد، اما استریل کردن ظروف شیشه ای با حرارت خشک ترجیح داده میشود، و احتمال آلودگی شیمیایی ناشی از تقطیر بخار و خوردگی قوطی های پیپت را جلوگیری کرد
• با این حال، استریلیزاسیون نیاز به یک کوره پرقدرت با فن دارد با دمای بالا (160 تا 180 درجه سانتیگراد) تا از گرم شدن یکنواخت در کل بار اطمینان حاصل شود
• برای دستیابی به دمای محفظه حداقل 250 درجه فارنهایت (121 درجه سانتیگراد) برای یک زمان تجویز شده - معمولاً 15 تا 20 دقیقه، 15 پوند بر اینچ مربع
• برای استریل کردن فیلترها از فیلترهای یکبار مصرف با اندازه 0.22 میکرومتر استفاده شود

تکنیک استریل

• هربار کشت ها با چشم و همچنین یک میکروسکوپ (ترجیحا فاز کنتراست) بررسی شود
• کشت ها بدون آنتی بیوتیک نگه داشته شوند، ترجیحاً در همه زمان ها، اما حداقل برای بخشی از زمان، برای آشکار کردن آلودگی های مخفی
• معرف ها و محیط‌ها از نظر استریل بودن بررسی شوند
• ظروف رسانه یا سایر معرف ها با افراد دیگر به اشتراک گذاشته نشود یا برای خطوط سلولی مختلف استفاده نشود
• استاندارد تکنیک استریل بالا نگه داشته شود
• عفونت مایکوپلاسما، که زیر میکروسکوپ معمولی نامرئی است، یکی از تهدیدهای اصلی میباشد
• اگر این آلودگی شناسایی نشود، میتواند در آزمایشگاه به سایر کشت ها سرایت کند
• بنابراین، پشتیبان گیری از بررسی های بصری با یک آزمایش مایکوپلاسما ضروری است، به ویژه اگر رشد سلول غیر طبیعی به نظر برسد

تکنیک آسپتیک

• تمام موادی که با کشت تماس مستقیم دارند، باید استریل باشند
• دستکاری ها باید به گونه ای طراحی شوند که هیچ ارتباط مستقیمی بین کشت و محیط غیر استریل آن وجود نداشته باشد
• جریان آرام
• دو نوع اصلی جریان: عمودی و افقی

دفعات تکرار HEPA

• فیلتر هوای ذرات با راندمان بالا (HEPA) اصلی بالای سطح کار باید هر شش ماه یکبار از نظر جریان هوا و سوراخ ها کنترل شود
• سوراخ ها را میتوان با افزایش موضعی جریان هوا و افزایش شمارش ذرات تشخیص داد
• از نور UV میتوان برای استریل کردن هوا و سطوح کاری آشکار در هودهای جریان لامینار بین استفاده ها استفاده کرد

ریختن محلول

• ریختن از یک ظرف استریل به ظرف استریل دیگر ممنوع میباشد، مگر اینکه ظرفی که از آن می ریزید فقط یک بار برای انتقال کل محتویات آن استفاده شود - خطر عمده در ریختن، ایجاد پلی بین بیرون و داخل بطری است، که اجازه میدهد در حین نگهداری یا انکوباسیون آلودگی وارد بطری شود

کنترل کننده های پیپت

• کنترل کننده های پیپت معمولاً دارای یک فیلتر در محل قرارگیری پیپت برای به حداقل رساندن انتقال آلاینده ها هستند
• برخی از فیلترها یکبار مصرف هستند و برخی دیگر پس از استریل مجدد قابل استفاده هستند
• عوامل اصلی تعیین کننده در انتخاب یک کنترل کننده پیپت، وزن و احساس ابزار در طول استفاده مداوم است

پیپتورها

• فقط نوک آن باید استریل باشد، اما طول نوک اندازه ظروف مورد استفاده را تعیین می کند
• اگر یک مایع استریل با یک پیپتور از یک ظرف خارج شود، ساقه غیر استریل نباید با دیواره های ظرف تماس پیدا کند

محیط های تعریف شده و مکمل ها

• بیشتر خطوط سلولی در pH 7.4 به خوبی رشد میکنند
• فنل قرمز معمولاً به عنوان یک شاخص رنگی استفاده میشود - این در pH 7.4 قرمز است و در pH 7.0 نارنجی، در pH 6.5 زرد، در pH پایین تر از 6.5 زرد ترشح میشود، در pH 7.6 صورتی تر و در pH 7.8 بنفش است
• دی اکسید کربن در فاز گازی در محیط حل میشود، یک تعادل با یون های ™HCO3 ایجاد میکند و pH را کاهش میدهد
• میزان تنش دی اکسید کربن هوا، با توجه به دما، به طور مستقیم غلظت دی اکسید کربن محلول را تنظیم میکند - این تنظیم به نوبه خود H2CO3 تولید میکند، که طبق واکنش تفکیک میشود H2O+CO2 ↔H2CO3 ⇔H+ +HCO3-
• HCO3- یک ثابت تفکیک نسبتاً پایین با بیشتر کاتیون های موجود دارد، بنابراین تمایل به پیوند مجدد دارد و محیط را اسیدی میکند
• محصول خالص افزایش CO2 هوا، کاهش pH است و با افزایش غلظت بی کربنات میتوان این اثر را خثنی کرد - NaHCO3 ⇔ Na+ + HCO3-
• این افزایش در غلظت ®HCO3- معادله (1) را به سمت چپ فشار میدهد تا زمانی که تعادل در pH 7.4 حاصل شود - اگر به جای آن از یک باز دیگر (به عنوان مثال، NaOH) استفاده شود، نتیجه خالص یکسان است: NaOH + H2CO3 → NaHCO3 + H2O ⇔ Na+ + HCO3- + H2O
• گنجاندن پیروات در محیط سلول ها را قادر میسازد تا تولید اندوژن دی اکسید کربن خود را افزایش دهند و آن ها را از دی اکسید کربن اگزوژن و همچنین HCO3 مستقل سازد
• اگرچه 20 میلی مولار HEPES میتواند pH را در محدوده فیزیولوژیکی کنترل کند، عدم وجود دی اکسید کربن اتمسفری به معادله (1) اجازه میدهد به سمت چپ حرکت کند، و در نهایت دی اکسید کربن محلول و در نهایت ®HCO3 را از محیط حذف می کند
• HEPES، در 10 تا 20 میلی مولار، یک بافر قوی تر در محدوده pH 7.2 تا 7.6 است.

درجه حرارت

• عمق محیط کشت میتواند میزان انتشار اکسیژن به سلول ها را تحت تاثیر قرار دهد، حفظ عمق محیط در محدوده 2 تا 5 میلی متر (0.2-0.5 میلی لیتر بر سانتی متر مربع) در کشت ثابت توصیه میشود - برای برخی از انواع سلول

درجه حرارت

• دمای بهینه برای کشت سلولی وابسته به (1) دمای بدن حیوانی است که سلول ها از آن گرفته شده است

خطوط سلولی حیوانات خونگرم

• درجه حرارت تقریباً 37 درجه سانتیگراد، نزدیک به گرمای بدن هستند، اما برای اطمینان درجه حرارت کمی پایین تر تنظیم میشود، زیرا گرم شدن بیش از حد یک مشکل جدی تر از گرما بسیار پائین است

کشش سطحی و کف کردن

• در صورت رسیدن کف به گردن ظرف کشت، خطر آلودگی وجود دارد

محلول های نمکی متعادل

• یک محلول نمکی متعادل (BSS) از نمک های معدنی تشکیل شده است و ممکن است شامل بی کربنات سدیم و در بعضی موارد گلوکز باشد
• BSS اساس بسیاری از رسانه های کامل را تشکیل میدهد
• BSS همچنین به عنوان یک رقیق کننده برای غلظت اسیدهای آمینه و ویتامین ها برای تهیه محیط های کامل، به عنوان شستشوی ایزوتونیک یا محیط تشریح، و برای دوره های کوتاه انکوباسیون تا حدود 4 ساعت (معمولاً با وجود گلوکز) استفاده میشود
• PBS بدون Ca2+ و Mg2+ به عنوان PBS محلول A شناخته میشود
• سالین بدون کلسیم و منیزیم (CMF) یا D-PBSA به منظور کاهش تجمع و چسبندگی سلولی
• HEPES (10 – 20 mM) در حال حاضر موثرترین بافر در محدوده pH 7.2 تا pH 7.8 است و Tricine در محدوده pH 7.4 تا pH 8.0، اگرچه هر دو در صورت استفاده در مقادیر زیاد گران هستند.

محیط های کامل

یک محیط کامل به معنای محیطی است که تمام اجزا و مکمل های آن اضافه شده و برای استفاده مشخص کافی است

• معمولاً از یک جز mediumی تعریف شده تشکیل شده است، اجزای ناپایدار آن، مانند گلوتامین، و مکمل های مختلف، مانند سرم، عوامل رشد یا هورمون ها، ممکن است درست قبل از استفاده اضافه شوند
• محیط‌های تعریف‌شده از نظر پیچیدگی از MEM ساده نسبی ایگل که حاوی اسیدهای آمینه ضروری، ویتامین‌ها و نمک‌ها است تا محیط‌های پیچیده مانند محیط 199 متغیر هستند
• CMRL 1066، MB 752/1، RPMI 1640، F12

محیط های پیچیده

• محیط های پیچیده حاوی تعداد بیشتری از اسیدهای آمینه مختلف از جمله اسیدهای آمینه غیر ضروری و ویتامین های اضافی هستند و اغلب با متابولیت های اضافی تکمیل میشوند
• نوکلئوزیدها، واسطه های چرخه اسید تری کربوکسیلیک، و لیپیدها) و مواد معدنی
• غلظت مواد مغذی، به طور کلی، در F12 پایین است (که با شبیه سازی بهینه شده است) و در اصلاح MEM (DMEM) ایگل دولبکو بالا است

اسیدهای آمینه

• اسیدهای آمینه ضروری (یعنی اسیدهایی که در بدن سنتز نمیشوند) توسط سلول های کشت شده مورد نیاز هستند، به علاوه سیستئین و/یا سیستئین، آرژنین، گلوتامین و تیروزین
• اسیدهای آمینه غیر ضروری نیز اغلب اضافه میشوند تا عدم توانایی نوع خاصی از سلول یا از دست دادن آن ها را با نشت به داخل محیط جبران کنند
• گلوتامین توسط اکثر سلول ها مورد نیاز است، اگرچه برخی از خطوط سلولی از گلوتامات استفاده میکنند. شواهد نشان میدهد که گلوتامین نیز توسط سلول های کشت شده به عنوان منبع انرژی و کربن استفاده میشود
• گلوتامین در محیط کشت ناپایدار است و نیمه عمر آن بین 3 تا 5 روز است و آمونیاک تولید میکند که میتواند به عنوان یک محصول جانبی سمی باشد. گلوتاماکس (Invitrogen) یک دی پپتید آلانین-گلوتامین است که به دلیل اثر دی پپتیداز پایدار و در دسترس است

محیط های کامل

• MEM ایگل فقط حاوی ویتامین های محلول در آب است (گروه B، به علاوه کولین، اسید فولیک، اینوزیتول و نیکوتین آمید، اما به استثنای بیوتین)
• سایر نیازها احتمالاً از سرم به دست می آیند
• تمام ویتامین های محلول در چربی (A، D، E و K) فقط در M199 وجود دارند، در حالی که ویتامین A در LHC-9 و ویتامین E در MCDB 110 وجود دارد
• نمک ها
• نمک ها عمدتاً شامل Na+، K+، Mg2+، Ca2+، Cl-، SO42-، PO43- و HCO3- و اجزای اصلی هستند که در اسمولالیته محیط نقش دارند
• کاتیون های دو ظرفیتی، به ویژه Ca2+، توسط برخی از مولکول های چسبندگی سلولی، مانند کادهرین ها مورد نیاز هستند
• Ca2+ در محیط میتواند بر این که آیا سلول ها تکثیر میشوند یا متمایز میشوند تاثیر بگذارد
• Na+، K+، و Cl- پتانسیل غشا را تنظیم میکند، در حالی که SO42-، PO43-، و HCO3- نقش هایی به عنوان آنیون های مورد نیاز توسط ماتریکس و پیش سازهای تغذیه ای برای ماکرومولکول ها، و نیز تنظیم کننده های بار داخل سلولی دارند
• برای به حداقل رساندن تجمع و اتصال سلولی، کلسیم در کشت های سوسپانسیونی کاهش می یابد

گلوکز

• گلوکز به عنوان منبع انرژی در اکثر محیط ها گنجانده شده است
• گلوکز عمدتاً توسط گلیکولیز متابولیزه میشود و پیروات تولید میکند، که میتواند به لاکتات یا استواستات تبدیل شود و میتواند وارد چرخه اسید سیتریک شود و برای تولید CO2 و آب اکسید شود
• تجمع اسید لاکتیک در محیط، به ویژه در سلول های جنینی و تغییر یافته مشهود است، به این معنی است که چرخه اسید سیتریک ممکن است به طور کامل مانند سیستم in vivo عمل نکند

مکمل های ارگانیک

• طیف متنوعی از مواد، از جمله پروتئین ها، پپتیدها، نوکلئوزیدها، واسطه های چرخه اسید سیتریک، پیروات و لیپیدها

هورمون ها و عوامل رشد

• آنتی بیوتیک ها
• آنتی بیوتیک ها معایب قابل توجهی دارند
• آن ها توسعه میکروب های مقاوم به آنتی بیوتیک ها را تشویق می‌کنند
• 2. در صورت حذف آنتی بیوتیک ها، تغییر شرایط کشت و یا توسعه گونه های مقاوم، وجود آلودگی‌های پنهانی در سطح پایین را پنهان میکنند که میتوانند به طور کامل عملیاتی شوند
• میتوانند عفونت های مایکوپلاسما را پنهان کنند
• 4. اثرات ضد متابولیکی دارند که میتوانند با سلول های پستانداران واکنش متقاطع داشته باشند
• باعث تکنیک آسپتیک ضعیف میشوند

محیط های کامل

• آلودگی های قارچی و مخمری به ویژه با آنتی بیوتیک ها به سختی کنترل میشوند - ممکن است مهار شوند، اما به ندرت حذف میشوند
• سرم شامل عوامل رشد است که باعث تکثیر سلول میشوند و عوامل چسبندگی و فعالیت ضد تریپسین، که باعث اتصال سلولی میشود - سرم همچنین منبعی از مواد معدنی، لیپیدها و هورمون ها است که بسیاری از آن ها ممکن است به پروتئین متصل باشند
• سرم های مورد استفاده در کشت بافت بیشتر شامل سرم گوساله گاوی، سرم جنین گاوی، سرم اسب بالغ و سرم انسانی است. سرم گوساله (CS) و سرم جنین گاوی (FBS) پرکاربردترین هستند که دومی به ویژه برای خطوط سلولی و شبیه سازی مورد تقاضا
• سرم انسان گاهی اوقات همراه با برخی از خطوط سلولی انسانی استفاده میشود، اما باید از نظر ویروس هایی مانند HIV و هپاتیت B غربالگری شود
• پروتئین
• مهم به عنوان حامل لیپیدها، مواد معدنی و گلبول ها
• باعث چسبندگی سلولی میشود
• ممکن است به ظرفیت بافری محیط بیافزاید

عوامل رشد

• TGF-β ممکن است رشد را مهار یا تمایز در سلول های اپیتلیال را تقویت کند
• فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGFs)
• فاکتور رشد اپیدرمی (EGF)
• فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) و آنژیوژنین
• عوامل رشد شبه انسولین IGF-I و IGF-II
• احتمالاً در سرم به مقدار کم وجود دارد

هورمون ها

• انسولین باعث جذب گلوکز و اسیدهای آمینه میشود
• IGF-II همچنین باعث تحریک جذب گلوکز میشود
• هورمون رشد ممکن است در سرم وجود داشته باشد - به ویژه سرم جنین
• هیدروکورتیزون نیز در سرم وجود دارد - به ویژه سرم جنین گاوی - به مقدار متغیر و میتواند چسبندگی سلولی را تشویق کند

انتخاب محیط و سرم

• RPMI 1640، DMEM و MEM محبوب ترین هستند و حدود 75 درصد فروش را تشکیل میدهند
• DMEM: دارای دو برابر غلظت اسید آمینه MEM است، 4 برابر غلظت ویتامین ها را دارد و از دو برابر HCO3- و غلظت CO2 برای دستیابی به بافر بهتر استفاده میکند
• "MEM: دارای اسیدهای آمینه و ویتامین های اضافی و همچنین نوکلئوزیدها و اسید لیپوئیک است. برای طیف گسترده ای از انواع سلولی از جمله سلول های خونساز استفاده شده است
• Ham's F12: به ویژه برای سنجش های کلونوژنیک و کشت اولیه
• محیط RPMI 1640 و Fischer برای سلول های لنفوئیدی توسعه داده شدند - Fischer ها خاص برای لنفوم L5178Y هستند که نیاز به فولات بالایی دارد
• RPMI 1640 به طور خاص کاربرد گسترده ای دارد، اغلب برای سلول های متصل
• L15 Medium به طور خاص برای ارائه بافر در غیاب HCO3- و CO2 توسعه داده شده است
• اغلب به همین دلیل به عنوان محیط حمل و نقل و کشت اولیه مورد استفاده قرار میگیرد، اما ارزش آن با معرفی HEPES و نشان دادن اینکه HCO3- و CO2 اغلب برای رشد سلول بهینه ضروری هستند، بدون در نظر گرفتن نیاز به بافر، کاهش یافت

آماده سازی و استریلیزاسیون

آلودگی میکروبی قابل مشاهده

• یک تغییر ناگهانی در pH، معمولاً کاهش در بیشتر عفونت های باکتریایی، تغییر بسیار کم با مخمر تا زمانی که آلودگی شدید نباشد و گاهی اوقات افزایش در pH با آلودگی قارچی
• کدر شدن محیط، گاهی اوقات با یک لایه نازک یا کف در سطح یا لکه هایی روی سطح رشد که هنگام جابجایی فلاسک از بین می رود

در این درس، به بررسی نیازهای خاص یک آزمایشگاه کشت بافت، از جمله جداسازی مناسب هود جریان لامینار و استفاده از کابینت های ایمنی میکروبیولوژیکی برای مواد خطرناک میپردازیم. همچنین هودهای جریان افقی را بررسی میکنیم. این درس برای پرسنل آزمایشگاه ها مفید است.